¿Qué es la amplificación LAMP?
La técnica LAMP ha sido empleada exitosamente para la detección de patógenos del tracto respiratorio como son la influenza en una reacción multiplex permitiendo la detección simultánea de influenza A y B [1] y permitiendo su diferenciación del virus SARS-CoV-2 facilitando la administración correcta del tratamiento. Para el diagnóstico de tuberculosis, el LAMP más rápida, ha demostrado tener una sensibilidad y especificidad más alta que la del PCR y el cultivo microbiológico permitiendo el diagnóstico rápido de esta enfermedad [2].
También se ha empleado en el diagnóstico de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae, agentes causantes de la neumonía, así como de diversas infecciones e incluso se ha empleado para determinar el estado de resistencia a antibióticos por parte de estas bacterias, como es la
resistencia a carbapenem [3, 4]
En infecciones virales, se ha empleado para la detección de hepatitis B y C, alcanzando una sensibilidad de 10 copias por reacción [5], la detección de infecciones activas de citomegalovirus en mujeres embarazadas a partir de una muestra de sangre, donde la infección congénita de no ser tratada puede causar desórdenes incluyendo la pérdida de la audición en el infante [6]. el diagnóstico temprano de la infección en la madre la cual muchas veces es asintomática, permite iniciar el tratamiento rápidamente ayudando a disminuir la secuelas neurológicas.
En los ensayos, el LAMP para citomegalovirus ha demostrado tener una sensibilidad del 87% y una especificidad del 97% con 10 copias del genoma viral. el LAMP también se ha propuesto en la mejora del algoritmo de diagnóstico de VIH, la CDC ha incluido un resultado positivo en pruebas de ácidos nucleicos para confirmar el diagnóstico, en este caso, se han propuesto pruebas LAMP de fácil uso en laboratorio y con la capacidad de detectar VIH-1 y VIH-2 (subtipos A y B) como una alternativa económica y de fácil acceso para la implementación del nuevo algoritmo [7].
Como uno de los tipos de patógenos más difíciles de tratar, el diagnóstico temprano de parásitos protozoarios se ha vuelto muy importante en las ultimas décadas, en este caso el LAMP se ha empleado con éxito para la detección de Plasmodium falciparum, agente causante de la malaria, detectando hasta 5 células por µL de sangre [8] y Trypanosoma cruzi, agente causante del mal de Chagas, una enfermedad de la que se considera 1 millón de infectados en México actualmente, con una presencia de la enfermedad en dos terceras partes del territorio, esta enfermedad es de importancia para el trasplante de órganos, recién nacidos de madres infectadas y cuyo contagio incluso se puede dar a través de alimentos contaminados [9].
Otros patógenos con detección exitosa mediante este método incluyen Helicobacter pylori, Leptospira, Trichomonas, Leishmania entre otras más [10, 11, 12, 13].
Agentes contaminantes de interés farmacéutico y alimenticio (bacterias),
La identificación de la contaminación en muestras ambientales, alimentos y productos farmacéuticos tiene en común que se realizan generalmente por ensayos microbiológicos que llevan varios días. El LAMP es una alternativa rápida que permite la detección de patógenos y su caracterización si estos rasgos son codificados genéticamente, como las toxinas, de una forma rápida y sencilla.
E. coli
Uno de los agentes contaminantes más habituales y peligrosos ya que puede causar daño renal y la muerte, es la bacteria E. coli serotipo O157: H7, productora de la toxina de Shiga y cuyo análisis puede llevar más de 3 días. Mediante la técnica LAMP, es posible determinar el serotipo, la presencia/ausencia de las dos toxinas de Shiga (Stx1 y Stx2) en 3 reacciones LAMP ejecutadas el mismo día [14].
Salmonella
Este patógeno es el principal agente contaminante en alimentos a nivel mundial. Esta bacteria puede causar envenenamiento por alimentos y enfermedades gastrointestinales. La determinación de la presencia de esta bacteria lleva de 4 a 6 días por métodos microbiológicos. en estudios realizados, la técnica LAMP permite determinar la presencia/ausencia del patógeno en 45 minutos y se ha logrado detectar de esta forma 214 cepas distintas con una sensibilidad del 97.7% [15]..
Vibrio parahaemolyticus
Bacteria de amplia distribución y de importancia al contaminar productos pesqueros y de acuacultura, siendo el causante del 70% de los casos de diarrea producidos por estos alimentos.
Actualmente la identificación de este patógeno requiere 7 días y es común que presente falsos negativos. Mediante el método LAMP, es posible determinar la presencia de este patógeno y caracterizar sus 2 factores de virulencia mediante 3 reacciones LAMP, con una sensibilidad de hasta 100 femtogramos por reacción y una sensibilidad arriba del 95% [16].
Staphylococcus
Hasta 30 tipos distintos de Staphylococcus han sido identificados, siendo el más común en la contaminación de alimentos la especie S. aureus responsable de múltiples enfermedades como infecciones cutáneas, neumonía, endocarditis, osteomielitis y gastroenteritis. El método LAMP permite la detección de hasta 100 copias de los genes de referencia (mecA, spa, femA) con una precisión del 98% probando contra 105 cepas de referencia [17]
Oncología
En Oncología, el método LAMP permite la detección rápida de mutaciones de interés para la prognosis y tratamiento del cáncer, en especial, cuando estas se localizan en hotspots específicos de los genes afectados, como son las mutaciones del gen BRAF (V600E) en cáncer rectal y melanomas donde se presenta hasta en un 90% de los melanomas con mutaciones en este gen y que permite el tratamiento con Vemurafenib y que ayuda en el combate de melanomas que ya iniciaron la metástasis. La detección de esta mutación mediante el método LAMP obtuvo una precisión del 100% respecto al PCR digital. [18]
El gen K-RAS (mutaciones del codon 12 y 13) presente en diversos tipos de cáncer siendo el más importante el colorrectal (37.7%) y cuya presencia inhibe el efecto del tratamiento con inhibidores de la tirosina cinasa por lo cual, es importante realizar la correcta estratificación de los pacientes y un adecuado uso de las terapias anti-EGFR [19].
Estas terapias son viables en el momento en que las mutaciones del gen EGFR (deleciones del exón 19, L858R, T790M) permiten una ventana de tratamiento mediante inhibidores de la tirosina cinasa, mejorando la calidad de vida del paciente. La detección mediante la técnica LAMP en muestras de pacientes con cáncer de pulmón alcanzó una precisión arriba del 95% a comparación del ensayo therascreen EGFR Rotor-Gene Q (RGQ) PCR Kit (Qiagen) [20], en un tiempo de reacción de 30 minutos.
Las mutaciones en los genes IDH1/IDH2 (R132 en IDH1 y R172 en IDH2) son marcadores para el diagnóstico como la prognosis de glioblastomas. Pacientes con la mutación en IDH1 tienen una mejor tasa de sobrevivencia además de que el conocimiento de esta mutación permite al cirujano
modificar el plan de acción en la cirugía. El método LAMP por su corta duración, permite realizar la determinación de la mutación durante el periodo de ejecución de la cirugía, algo que ninguna otra técnica molecular puede en la actualidad, y así ajustar el plan de acción [21].
Otros tipos de mutaciones en las que el método LAMP puede ser de utilidad pero que aún no hay pruebas desarrolladas son las fusiones del gen NTRK en diversos tipos de cáncer y mutaciones del gen tp53 el cual presenta mutaciones en el 60% de todos los tipos de cáncer humanos [22]. El desarrollo de pruebas LAMP de uso oncológico es posible si la mutación es principalmente una sustitución o deleción y que estas sucedan en hotspots definidos.
Para los laboratorios que no cuentan con un termociclador y necesitan ofrecer pruebas moleculares, la prueba RT-LAMP es accesible, rápida y precisa. A diferencia del RT-PCR, cuyo procesamiento es costoso y muy delicado, la prueba RT-LAMP entrega precisión similar a muy bajo costo.
La prueba permite la detección en muestras de hisopado nasofaríngeo, orofaríngeo y en saliva. Además de ser rápida solo se requiere 1 h para obtener resultados, no requiere reactivos o instrumentos costosos como termocicladores, es fácil de realizar e interpretar, lo cual la convierte en una excelente herramienta útil para punto de atención.